这篇12分文章教您如何研究外泌体LncRNA----外泌体lncRNA介导膀胱癌淋巴转移-技术前沿-资讯-生物在线

这篇12分文章教您如何研究外泌体LncRNA----外泌体lncRNA介导膀胱癌淋巴转移

作者：上海云序生物科技有限公司 2020-03-04T10:25 (访问量:6322)

文章导读

外泌体是指包含多种RNA（环状RNA、miRNA、LncRNA和mRNA等）和蛋白质的盘状囊泡（30-200nm）。几乎所有类型的细胞均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于各种体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，能够参与细胞间通讯。目前，有关外泌体分泌、摄取、内容物以及相应功能的精确分子机制的研究才刚刚起步，对外泌体的研究兴趣也是日益增长。

2020年2月6日，外泌体领域大牛Raghu Kalluri教授在Science杂志（影响因子41.037）发表了关于外泌体的综述，该综述介绍了外泌体的生物发生、异质性、以及细胞间通信过程，同时也分析总结了外泌体在哺乳动物的繁殖和发育、神经退行性疾病、代谢和心血管疾病、免疫反应和感染、癌症以及在临床诊断和治疗应用等领域中的重要价值，激发了该领域的研究热度。2020年1月2日，The Journal of Clinical Investigation杂志（影响因子12.282）刊登了一篇外泌体lncRNA LNMAT2促进膀胱癌淋巴转移过程的文章。该篇文章巧妙利用多种技术揭示了外泌体lncRNA介导的淋巴转移机制，并将LNMAT2作为膀胱癌淋巴转移的治疗靶点。

发表期刊：The Journal of Clinical Investigation

影响因子：12.282

实验方法：LncRNA-seq、RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP、双荧光素酶报告实验（云序可提供以上服务）

实验样本：淋巴转移膀胱癌组织vs.非淋巴转移膀胱癌组织（5 vs. 5 ）

文献链接：

https://www.jci.org/articles/view/130892/pdf

文章内容

（1）LNMAT2过表达与BCa淋巴结转移相关

作者前期通过对5对淋巴转移膀胱癌组织（LN+）和非淋巴转移膀胱癌组织（LN-）进行LncRNA-seq（云序可提供此服务）发现，LNMAT2在淋巴转移膀胱癌（Bca）组织明显上调；对266名膀胱癌组织进行qPCR，结果显示LNMAT2在LN+中明显上调；K-M分析显示，LNMAT2过表达的膀胱癌病人生存率（OS）和无病生存率（DFS）明显少于低表达LNMAT2组。这些数据说明LNMAT2过表达可能引起BCa的LN转移。

图注：LNMAT2过表达与BCa淋巴结转移相关

（2）LNMAT2在BCa细胞分泌的外泌体中富集

作者利用ISH实验发现，在BCa的胞外间隙中有较高的LNMAT2表达（D）；与LN（-）-BCa组织相比，LN（+）-BCa组织中细胞外LNMAT2的表达明显升高。细胞外lncRNA主要被包裹在特定的亚细胞物质中（特别是外泌体），提示LNMAT2可能被BCa细胞外泌体包裹。为了验证这一假设，作者从206例BCa患者和120例健康对照组的尿液样本中分离出外泌体并进行qPCR实验，发现与健康对照组相比，来自BCa患者的尿液外泌体中LNMAT2表达上调。这提示外泌体LNMAT2对BCa的发生发展有重要意义。

图注：LNMAT2在BCa细胞分泌的外泌体中富集

（3）BCa细胞分泌的外泌体LNMAT2在体外促进淋巴生成

作者首先对BCa细胞系（5637和UM-UC-3）进行外泌体鉴定；下调/过表达LNMAT2的BCa细胞系外泌体与人淋巴内皮细胞（HLEC）共孵育，血管形成实验和迁移实验发现下调LNMAT2能够抑制HLEC的血管形成和迁移，上调LNMAT2则相反；体内实验证明，上调LNMAT2能促进淋巴生成。

图注：BCa细胞分泌的外泌体LNMAT2在体外促进淋巴生成

（4）hnRNPA2B1介导LNMAT2包装进入BCa细胞外泌体

为了探究LNMAT2的分子机制，作者进行LNMAT2 RNA pull-down+MS（云序可提供此服务）实验，结果显示hnRNPA2B1能够与LNMAT2直接结合；为了验证MS结果，作者进行LNMAT2 RNA pull-down+WB、RIP+qPCR（云序可提供此服务）实验，结果显示LNMAT2确实能够与hnRNPA2B1直接结合；而且FISH实验显示LNMAT2和hnRNPA2B1能够定位于细胞核；为了探究LNMAT2是如何进入BCa细胞外泌体的，作者在BCa细胞系中敲减hnRNPA2B，发现外泌体中LNMAT2的表达降低。这些结果说明hnRNPA2B1能够介导LNMAT2包装进入BCa细胞外泌体。

图注：hnRNPA2B1介导LNMAT2包装进入BCa细胞外泌体

（5）外泌体LNMAT2上调PROX1的表达

有研究报道，PROX1通过调节内皮细胞的分化和转移，对淋巴管系统发育至关重要。因此作者通过qPCR和WB实验发现，HLECs中上调LNMAT2能够促进PROX1的表达；为了探究LNMAT2调控PROX1表达的分子机制，作者进行核质分离PCR，发现LNMAT2主要存在于HLECs的细胞核中；为了探究LNMAT2是否参与启动子区结合，作者针对PROX1上游-2000 bp到下游+200bp分区间进行双荧光素酶报告实验（云序可提供此服务），结果显示PROX1在-650bp到-350bp区间的荧光值明显升高，说明该区域能够与LNMAT2结合。

图注：外泌体LNMAT2上调PROX1的表达

（6）外泌体LNMAT2与hnRNPA2B1互作促进PROX1启动子区H3K4三甲基化

研究发现，hnRNPA2B1能够通过与目标DNA结合参与H3K4三甲基化（H3K4me3）相关的表观遗传调控。为了探究hnRNPA2B1是否也具有类似功能，作者通过ChIP实验（云序可提供此服务）验证，在LNMAT2过表达的HLECs中，hnRNPA2B1与H3K4me3都与PROX1启动区结合能力增强，反之亦然；这说明外泌体LNMAT2通过与hnRNPA2B1直接互作提高PROX1启动子中H3K4me3的水平。

图注：外泌体LNMAT2与hnRNPA2B1互作促进PROX1启动子区H3K4三甲基化

（7）外泌体LNMAT2诱导PROX1上调促进淋巴淋巴转移

为了明确PROX1是否为BCa外泌体LNMAT2诱导淋巴管生成所必需的，作者进行了PROX1挽救实验，发现PROX1过表达能够回补外泌体LNMAT2过表达导致的抑制HLEC血管形成和迁移现象；相反，PROX1沉默明显消除了外泌体LNMAT2诱导的HLEC血管形成和迁移现象。

图注：外泌体LNMAT2诱导PROX1上调促进淋巴转移

（8）外泌体LNMAT2与BCa患者的淋巴结转移有关

研究证明，BCa细胞分泌的外泌体lncRNA可以在尿液中检测到，并且这些尿液外泌体lncRNA被认为可以作为早期诊断BCa的生物标志物，作者对另外206例BCa患者尿液外泌体进行qPCR，结果显示LNMAT2在LN（+）BCa中明显上调；KM分析显示尿液外泌体LNMAT2高表达BCa患者的OS 和DFS是降低的；ROC曲线分析显示尿外泌体LNMAT2可以作为BCa和LN（+）BCa诊断的生物分子标志物。

图注：外泌体LNMAT2与BCa患者的淋巴结转移有关

总结

总体来说，该研究通过LncRNA-seq（云序可提供此服务）筛选了在淋巴转移的膀胱癌中上调的LNMAT2，并通过原位杂交实验将LNMAT2与膀胱癌外泌体联系在一起，并巧妙利用了RNA pull-down+MS/WB、RIP、ChIP以及双荧光素酶报告实验等方法（云序可提供以上服务），探究hnRNPA2B1介导LNMAT2进入膀胱癌外泌体中，外泌体LNMAT2被人淋巴管内皮细胞摄取内化后，通过募集hnRNPA2B1和增加PROX1启动子上的H3K4三甲基化水平，进一步上调PROX1表达，最终导致淋巴管生成和淋巴转移。这为研究和理解生物体复杂的外泌体调控机制，提供了比较完整的实验研究思路和方案，具有很强的理论先导性和示范性，也为疾病的调控和靶点提供了重要的理论依据。

图注：膀胱癌外泌体LNMAT2调控淋巴转移的分子机制

云序生物作为以高通量测序技术为依托的科研服务公司，拥有丰富的微量样本测序经验，为众多临床与基础科研研究者提供了高质量的科研服务，助力客户发表过众多微量样本的SCI文章，其中包含多篇外泌体文章。云序生物提供从外泌体提取、外泌体鉴定、外泌体全转录组测序、RIP、RNA pull-down和双荧光素酶报告实验等一站式服务，协助用户实现快速发表外泌体成果。