中性粒细胞分离的三种方法-技术前沿-资讯-生物在线

中性粒细胞分离的三种方法

作者:上海启达生物科技有限公司 2024-01-05T00:00 (访问量:29326)

一、标准方法:Ficoll-泛影钠(Ficoll-Hypaque)密度梯度及红细胞裂解法

(1)取一50ml聚乙烯管,无菌采集人外周静脉血,加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min,离心,室温。

(2)吸出富含血小板的上清,2500gX15min,制备无血小板血浆(platelet-poor Plasma, PPP)。

(3)余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000,用无菌生理盐水配制),并用生理盐水(0.9%)调节最终体积至50ml,轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

(4)吸出富含白细胞的上层液,275gX6min。

(5)沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水(1:4)重悬,并移到15ml离心管中。

(6)悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque(密度1.077),750gX5min,室温。

(7)吸取富含中性粒细胞和红细胞层,用0.155M NH4Cl重悬细胞,使红细胞裂解,然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液(HBSA,无钙)洗2次,最终用HBSA(含钙)重悬。

(8)用此法可得95%以上的中性粒细胞。

 二、不连续的密度梯度血浆-Percoll离心法

(1)先制备Percoll储存液:Percoll原液(100%):0.9%NaCl的体积比为9:1。

(2)取一50ml聚乙烯管,无菌采集人外周静脉血,加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min,离心,室温。

(3)吸出富含血小板的上清,2500gX15min,制备无血小板血浆(platelet-poor Plasma, PPP)。

(4)余下的沉降全血加入5ml 6%Dextran (分子量500,000,用无菌生理盐水配制),并用生理盐水(0.9%)调节最终体积至50ml,轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

(5)吸出富含白细胞的上层液,275gX6min。

(6)沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬。

(7)在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液,275gX10min。

(8)单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间,中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除,也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。

(9)中性粒细胞层用PPP液冼1次,再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液(KRPD,PH7.23)洗1次。

(10)用这种方法可得80%中性粒细胞,纯度在95%以上。

 三、“无LPS”方法(LPS-Free method)

(1)已有用变形细胞(如白细胞)裂解的方法表明,容器及溶液的不含LPS,也就是说,LPS的含量小于 0.1ng/ml。

(2) 无菌采集静脉血,用10%柠檬酸钠抗凝。

(3)抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000),比例为3:1(vol/vol,blood/dextran),室温,1小时。

(4) 收集白细胞的血浆,离心,去上清。

(5)红细胞用低渗的0.2%NaCl裂解15秒(此步也可用0.155M NH4Cl 15秒代替)。

(6)离心前立即加入10ml 1.6%NaCl(含糖(dextrose) 2mg/ml)。

(7) 离心后用KRPD洗2次。

(8)此法得到中性细胞数与方法2类似,但纯度只有80-85%,余下为淋巴细胞及单核细胞。

4、从3中所获得的中性粒细胞进行纯化

(1)因为方法3只能获得80-85%纯度的中性粒细胞,可以把方法2与方法3联合对中性粒细胞进行纯化。

(2)收集从方法3 dextran沉降所得到的富含白细胞的血浆,275g*6min,离心。

(3)管底沉淀用2ml PPP重悬。

(4)在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液,275gX10min。

(5)分别用PPP及KRPD各洗1次。

(6)用这种方法所得的中性粒细胞纯度高达99%以上,并且中间不需要红细胞裂解的步骤。

krebs-Ringer phosphate(KRPD缓冲液)的配制:

130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4

配制方法:

A液:NaCl 7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g,glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解;

B液:NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g,加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O 0.3130g,充分溶解。

将A、B混合,用ddH20将体积调节至990ml左右,用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4,定容至1000ml。

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