多不饱和游离脂肪酸（FFA）如花生四烯酸等，主要由膜磷脂上的磷脂酶活性释放，长期以来被认为对学习和记忆有益，并且是机体神经传递和突触可塑性调节剂。然而，在学习过程中大脑特定区域的其他 FFA 和磷脂变化的确切机制尚不清楚。昆士兰大学脑研究所Frédéric A. Meunier团队采用FFAs的敏感同位素标记多重分析（FFAST）和靶向脂质组学方法来表征大鼠大脑中的 FFA 和磷脂，以探讨磷脂衍生的 FFA 增加在学习和记忆形成中所起的作用。
磷脂和游离脂肪酸在大鼠脑内分布不均匀
分别采用两种互补的脂质组学技术检测大鼠脑组织中磷脂和 FFA 的变化。FFAST 使用微分稳定同位素标记法标记 FFA 的羧基，对大鼠大脑 6 个区域的 18 种FFA进行靶向定量获得 FFA 浓度（pmol/mg）；在磷脂分析方面，使用负离子模式ESI-MS，将磷脂生成前体离子sn-1/sn-2酰基片段。用冷的人工脑脊液灌注以减少缺血和死后脂质代谢，从解剖组织（中央杏仁核、基底外侧杏仁核、前额叶皮层、腹侧海马、背侧海马和小脑）中分别提取 FFA 和磷脂并进行独立分析（图 1a-b）。堆积条形图展示了 FFA 和 5 类磷脂（磷脂酸-PA、磷脂酰胆碱-PC、磷脂酰乙醇胺-PE、磷脂酰甘油-PG 和磷脂酰丝氨酸-PS）的平均浓度（图 1d-i）。结果表明，FFAs和磷脂在大脑区域中分布不均；相对于组织重量，杏仁核和前额皮质的浓度最高，海马背侧和小脑的浓度最低。饱和FFAs（6:0–24:0）占大脑各区域FFAs的绝大部分，其中PC和PE在整个大脑中的含量最高。
（图1）
磷脂和FFAs对联想学习有反应
杏仁核中磷脂和FFA的丰度非常高，提示其可能参与杏仁核有关的学习和记忆获取。通过研究脂质对听觉恐惧条件反射（AFC）的反应来探索这种可能性。AFC 是一种广泛使用的学习范式，在这种范式中，动物学会将中性听觉音调与轻度电击联系起来。暴露于配对音调/电击 AFC 刺激的大鼠对随后的仅音调刺激表现出明显的冻结（图2a-b），对照组大鼠暴露在相同数量的未配对音调中。作者试图确定这种长期学习行为是否与动物大脑（尤其是杏仁核）中脂质结构变化有关。N-甲基天冬氨酸（NMDA）受体在恐惧学习中至关重要，竞争性NMDA受体拮抗剂（6）-3-（2-羧基哌嗪-4-yl）丙基-1-膦酸（CPP）通常被用于阻断联想学习。作者测试了与盐水注射的动物相比，用CPP阻断NMDA受体是否改变对AFC的脂质反应。通过比较四个队列动物的脂质组谱（图2a）以评估FFA和磷脂对AFC的反应，当CPP阻断长期恐惧记忆获取时，这种活性依赖的反应是如何被调节的，从而识别出丰度变化与 NMDA 依赖的长期记忆相关的脂质种类。在全脑水平上，AFC与生理盐水注射导致许多FFA显著增加（饱和肉豆蔻酸增加最显著），大量磷脂的显著减少（图2c）。在CPP条件下配对AFC的特征是FFAs和磷脂的减少（图2d）。在生理盐水处理的动物中，AFC导致FFAs显著增加，PG略有增加，PA、PC、PE和PS均减少（图2d）。相比之下，在CPP处理的动物中，AFC在所有类别中均呈减少趋势。
（图2）
层次聚类热图（图3a）显示FFAs和特定类别的磷脂聚在一起，表明对AFC的反应相似，FFAs在整个大脑中呈增加趋势，在中央杏仁核观察到最强的影响，肉豆蔻酸的影响最强；腹侧海马的 PA 和 PC 水平显著降低，而中央和基底外侧杏仁核的 PE 水平降低，腹侧海马的 PG 水平增加，前额叶皮层中的所有脂质类别均略有增加（图 3a-b，框1-5）。CPP可调节这些反应，但其作用在中央杏仁核和海马背侧最为显著，其中大多数被检测的脂质丰度显著减少。尽管 CPP 本身会影响整个大脑中 FFAs 的基础水平，但这些变化与响应活动的区域特异性CPP效应无关。
（图3）
FFA反应与长期恐惧记忆的形成相关
如图2和3所示，FFAs（特别是饱和肉豆蔻酸和棕榈酸）对AFC的响应表现出最显著的活性依赖性变化。本研究使用AFC能够确定这些大脑特定区域对FFA谱的改变是否与对恐惧条件反射的持久学习反应相关。在 AFC 之后0 小时和几小时（图 2b），生理盐水和 CPP 处理的动物通常仅对音调的刺激表现出非常相似的冻结反应，这表明在不依赖NMDA受体的方式下，对配对刺激获得了相同的短期学习反应。然而，随后的恐惧记忆巩固是 NMDA 受体依赖性的，因为它可以被CPP 阻断。AFC 后 24 小时（图 2b），生理盐水处理的动物保持对音调的冻结反应，而 CPP 处理的动物则表现出显著减弱的反应。在 AFC 后 2 小时测定脂质，此时 FFA 对配对 AFC 刺激的反应在生理盐水和 CPP 处理的动物之间始终不同，即使两组在此阶段表现出相似的冻结行为，表明由对 AFC 的短期反应引起的大脑 FFA 谱的变化是巩固长期记忆所必需的。通过抑制 NMDA 受体来阻止这些特征变化与记忆巩固失败相关。为了确认FFA反应的定量变化与记忆获取的关系，本研究使用多元分析评估了4个实验条件下6个脑区24个样本获得的FFA谱的关系，3456个个体FFA测量值被压缩成一个18 FFA x 24的阵列，每个阵列元素代表8只大鼠FFA的平均测量值。使用 isomap 算法通过非线性降维 (NLDR) 对阵列进行分析，结果证实FFA对CPP处理和AFC刺激的广泛响应， NLDR 根据四种实验条件可以很容易地对配置文件进行分组，这与长期记忆巩固相关（图 2b）。
FFA对AFC的反应在杏仁核最强
生理盐水和 CPP 处理的动物中， FFA 对 AFC 的反应在杏仁核尤其是中央杏仁核最为显著（图 4a-b），主要是饱和的 FFA，特别是肉豆蔻酸及棕榈酸。花生四烯酸是反应最强烈的不饱和 FFA。本研究中使用的6-8 周代表青春期中后期雄性动物，已有研究表明青春期对负面事件的情绪反应会增强；与成年鼠相比，青春期鼠因恐惧而产生冻结行为的消失程度大大降低。本研究中观察到的杏仁核中FFA反应增高可能至少部分反映了青春期雄性鼠的发育过程。虽然推测 FFA 的增加与 AFC 突触中磷脂酶活性导致的磷脂减少相关，但磷脂在脑组织中的浓度远高于 FFA，给定的 FFA 种类可能来自多种磷脂和其他底物（如溶血磷脂和酰基甘油）的酶促加工。当对测量的磷脂类别中最常见的酰基种类求和时（图 4c），FFA 酰基种类的分布并不简单地反映特定磷脂分类中酰基种类的分布，也不能反映总磷脂的分布，提示在记忆获取过程中会出现某种程度的磷脂酶特异性，尤其是游离肉豆蔻酸的相对丰度高，而含肉豆蔻酰基的磷脂相对丰度低（图 4c）。值得注意的是，在中央杏仁核中，PA/PC/PS 磷脂中20:4_14:0，22:6_14:0 和 16:0_14:0 减少（图 3a）。相反，游离棕榈酸并不反映其在磷脂，尤其是磷脂酰胆碱中的相对丰度高，且磷脂底物加工具有很强的大脑区域特异性。整个大脑中肉豆蔻酸活性依赖性增加，并不是反映到这些区域中含有肉豆蔻酰基的磷脂底物的补充性减少（图 4d）。
（图4）
小结
本研究将脂质组学方法与AFC 结合阐述：（1）磷脂和 FFA 在大鼠大脑中的分布是异质的，在杏仁核中浓度最高；（2）磷脂和 FFA 分布在整个大脑中发生变化以活动依赖的方式响应 AFC；（3）变化特征是饱和脂肪酸（特别是肉豆蔻酸）和较低程度的不饱和脂肪酸（特别是花生四烯酸）可能从磷脂底物中释放；（4）用NMDA受体拮抗剂CPP阻断这些变化与长期记忆巩固失败有关，但对AFC的短期反应并无影响。以上结果表明由NMDA受体调控的FFA变化是学习和记忆形成所必需的。大脑区域特异性的FFA对AFC最大的反应在杏仁核和前额皮质，前脑的前额皮质对AFC的反应第二大，高于海马体。
本研究将FFA 谱与脑功能建立联系并解析全脑FFA随学习变化的轮廓，明确了进一步研究磷脂及其代谢物在记忆形成的重要意义。在获取恐惧记忆过程中产生的特定饱和/不饱和的FFAs与该记忆的长期巩固相关，但FFAs介导这种巩固的机制目前仍不清楚。将脂质组学技术的新发展与动物学习和记忆模型相结合，对于揭示这些FFAs在学习和记忆中的具体作用至关重要。
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参考文献
Tristan P. Wallis, Frédéric A. Meunier, et al. Saturated free fatty acids and association with memory formation. Nature Communications. 2021. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23840-3.
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