通过计算机断层扫描（CT）鉴别诊断肺部结节在临床实践中具有挑战性，现今仍有必要开发可靠、方便的生物标志物，早期正确识别肺癌，并在最初发现时区分大多数良性结节，以便对恶性肿瘤展开后续治疗。
2023年4月24日，中山大学胡寓旻、刘万里和栾天罡团队在国际知名期刊Nature Communications上正式发表了题为“Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera”的研究性文章，该研究表征了480份血清样本的代谢组，包括健康对照，良性肺结节和I期肺腺癌。腺癌组具有明显的代谢组学特征，而良性结节和健康对照组在代谢组学谱上表现出相似性。该研究证实了血清代谢物生物标志物在CT筛查肺结节风险评估中的价值。
血清代谢组学分析
本研究采用非靶向代谢组学，通过高分辨液相色谱-串联质谱仪（UPLC-MS/MS）对174个健康对照组（HC）、170个良性肺结节组（BN）和136个I期肺腺癌组（LA）的血清样本进行分析。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）图中，LA与BN组、LA与HC组之间有明显的代谢组学特征分离趋势。而在BN与HC组之间分组不明显。LA与HC组之间有382个差异代谢物，LA与BN组之间有231个，BN与HC之间有95个（Wilcoxon秩和检验，FDR < 0.05且FC值> 1.2或< 0.83），根据m/z值、保留时间和质谱碎片的进一步筛选，最终在LA和BN组和LA 和HC组之间，确定了33个和38个显著差异代谢物。考虑到在肺腺癌亚型中表皮生长因子受体（EGFR）的基因突变较常见，本研究分析了肺腺癌组中72例具有可用EGFR状态信息的病例样本的整体代谢组学特征，发现有7个代谢物在EGFR突变型患者与EGFR野生型患者之间的代谢丰度显著改变（VIP＞1，p < 0.05，FC > 1.2或 < 0.83）。7个代谢物中有5个是酰基肉碱，在脂肪酸氧化途径中起重要作用。
图1. 与健康对照和良性结节相比，肺腺癌的血清代谢组存在显著差异
开发、优化和验证差异血清代谢物的分类模型
在LA（n = 136）与BN（n = 170）组之间鉴定到的33个差异代谢物的基础上，通过二元逻辑回归建立代谢物生物指标模型，采用十折交叉验证（10-fold cross validation）来测试模型的稳健性。在内部验证（n = 104）和外部验证（n = 111）队列中分别进行代谢组学分析，以验证分类模型的分类性能。在发现队列(n = 306)中鉴定了27种代谢物，进行ROC分析得到AUC（Area Under Curve）为0.933（AUC值越接近1，表示分类器性能越好），以及0.868的敏感性和0.859的特异性。
该分类模型在内部验证队列和外部验证队列中得到了进一步的验证。在内部验证队列中，AUC为0.915（敏感性0.867，特异性0.811），而在外部验证队列中，AUC为0.945（敏感性0.810，特异性0.979）。将外部队列中的40个样本在外部实验室进行了分析，分类准确性AUC为0.925。由于鳞状细胞肺癌（LUSC）是非小细胞肺癌（NSCLC）中仅次于腺癌的第二常见亚型，该研究还测试了经验证的代谢标志物在由74例BN和16例LUSC组成的队列中的潜在适用性。对于LUSC vs BN的区分，AUC为0.776，相比于LUAD vs BN的区分能力较弱，表明该方法不适用于LUSC筛查。
图2. 用于区分良恶性肺结节的血清代谢分类模型的开发和验证
血清代谢分类模型对同尺寸结节的诊断能力
在CT图像上，结节大小与恶性概率呈正相关，并仍是结节管理的主要决定因素。直径大于6mm且没有明显良性特征的结节被称为不确定性肺结节（IPN），在临床实践中仍然是评估和管理的主要挑战。通过合并来自发现组和内部验证组的样本，进一步研究了结节大小对代谢组学特征的影响。首先比较了直径小于6mm的健康对照组和良性结节的代谢组学主成分分析（PCA），发现大部分数据点重叠在健康对照组和良性结节之间，显示两组血清代谢物含量的相似性，而在直径为6-20mm的恶性结节之间观察到了两组间分离，该队列在预测直径6-20mm的结节的恶性率时，达到了0.927的AUC，0.868的特异性和0.820的灵敏性。结果表明，这一分类器可能能够捕捉早期恶性转化引起的代谢变化，无论结节大小如何。
图3. 血清代谢分类器对相同大小范围内结节的预测效果
色氨酸代谢变化与肺腺癌的主动糖酵解有关
通过MetaboAnalyst进行的KEGG通路富集分析显示，在两个给定组（LA对比HC和LA对比BN）之间存在6个常见的显著改变的通路，包括丙酮酸代谢、色氨酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、糖酵解、TCA循环和嘌呤代谢。通过三重四极杆质谱仪(QQQ)进行靶向代谢组学研究，绝对定量验证主要的代谢变化，确认了LA组相对于BN组和HC组中升高的次黄嘌呤、黄嘌呤、丙酮和乳酸水平；同时，BN组和HC组之间这些代谢物没有显著差异。
考虑到LA组色氨酸代谢的显著影响，评估了所有组中的血清色氨酸水平，发现LA组的血清色氨酸含量较HC组和BN组显著降低（p < 0.001），这与之前的研究结果相符，即与健康对照组相比，肺癌患者的循环色氨酸水平较低。另一项使用11C-甲基-L-色氨酸作为PET/CT示踪剂的研究表明，与良性病变或正常组织相比，肺癌组织中色氨酸信号的滞留明显延长。由此推测，LA组血清色氨酸的降低可能反映了色氨酸被活跃地摄取到肺癌细胞中。
已知色氨酸代谢的最终产物是NAD+，它是糖酵解中丙酮酸-3-磷酸和1,3-二磷酸甘油酸反应的必需底物。SLC7A5是色氨酸转运蛋白。喹啉酸磷酸核糖转移酶（QPRT）是在色氨酸代谢途径下游将喹啉酸转化为NAMN的酶。对LUAD的TCGA数据集的调查显示，与正常组织相比，肿瘤组织中SLC7A5和QPRT均显著上调。在I&II期和III&IV期的肺腺癌中均观察到这种升高，表明与肿瘤发生相关的色氨酸代谢异常出现在早期。
此外，LUAD-TCGA数据集显示癌症患者样本中SLC7A5和GAPDH mRNA表达呈正相关。相反，在正常肺组织中这两种基因标记之间没有显著相关性。在A549细胞中敲除SLC7A5后，色氨酸和NAD(H)的细胞水平显著降低，导致胞外酸化率（ECAR）的下降，表明糖酵解活性的减弱。因此，基于血清代谢变化和体外实验，表明色氨酸代谢可能通过kynurenine犬尿氨酸途径产生NAD+在促进肺癌的糖酵解过程中起重要作用。
图4. 肺腺癌色氨酸代谢与糖酵解活性的相关性
小结和展望
肺腺癌（LUAD）和鳞状细胞癌（LUSC）是非小细胞肺癌（NSCLC）的两种主要亚型。由于LUSC与吸烟有很高的关联性，而LUAD是CT筛查中检测到的偶然发现的肺结节中最常见的组织学类型，因此分类器模型是专门建立在I期腺癌样本上的，因而在预测LUSC时准确性较低（AUC 0.776），这表明LUAD和LUSC可能存在各自的代谢组学特征。已有研究表明LUAD和LUSC在病因、生物学起源和基因异常方面存在差异。因此，在筛查项目的一般人群中，应该将其他类型的组织学类型纳入分类模型，以便检测肺癌。
该研究观察到肺腺癌患者血清中丙酮和色氨酸代谢之间存在负向相关。与HC组或BN组相比，LA组的血清色氨酸水平降低。推测肺腺癌患者血清色氨酸的耗竭可能反映了对该代谢物的快速消耗。已知通过色氨酸的犬尿酸途径进行的色氨酸代谢的最终产物是新生NAD+的来源。由于大部分NAD+是通过回收途径产生的，色氨酸代谢中NAD+的相关性在健康和疾病中仍需进一步研究。对TCGA数据库的分析显示，色氨酸转运蛋白7A5（SLC7A5）在肺腺癌中明显上调，与糖酵解酶GAPDH的表达呈正相关。先前的研究集中于色氨酸代谢对抑制抗肿瘤免疫反应的作用。该研究证明了通过敲除肺癌细胞中SLC7A5来抑制色氨酸摄取，导致细胞NAD水平降低以及糖酵解活性减弱。因此，该研究为肺腺癌的恶性转化所关联的血清代谢改变提供了实验依据。
综上所述，该研究建立了用于肺结节鉴别诊断的血清代谢分类器，并提出了一种基于CT筛查的优化工作流程，以便进行风险评估并促进临床管理。
参考文献
Metabolomic differentiation of benign vs malignant pulmonary nodules with high specificity via high-resolution mass spectrometry analysis of patient sera. Nature Communications. 2023.
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