知识要点：荧光标记的流式抗体种类繁多，荧光素的激发光谱与发射光谱各异，给抗体选择、荧光搭配等带来了诸多困扰。需要注意：荧光素的激发波长需要与可激发发光的激光器匹配，荧光素的激发光谱峰值尽可能接近仪器激光的激发光波长。此外，荧光素的激发波长必须选用相应波段检测器接收，以达到同时检测的目的。

荧光素的搭配依据

流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定：流式细胞仪检测的通道数、需要同时检测的荧光抗体数、厂家抗体的荧光种类及数目。
（1） 激光管数目以及每根激光的功能决定检测的通道数量，即可同时检测的指标数量。注意以下两点：
① 流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1/ FL2/ FL3三个颜色；而选配的FACSCalibur配有488nm和635nm两根激光，能做FL1/ FL2/ FL3/ FL4四个颜色。
② 不同型号的仪器同一通道检测荧光素的能力是不一样的，比如FACSCalibur的FL3能检测PE-Cy5/PerCP/PerCP-Cy5.5/PE-Cy7，而Aria只能检测PE-Cy5/PerCP。

（2） 需要同时检测的指标数量超过了仪器能力范围：拆开分管标记。如下例，

计划检测5个指标，而流式细胞仪只有4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。如同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

（3） 厂家提供的荧光素种类及数目：供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的。尽量选择说明书中有流式图的抗体。

荧光素搭配原则:
（1） 根据仪器选择荧光素
① 每个通道只能选择一个荧光素
以calibur为例，FL1选择了FITC就不能选择AlexaFluor488; FL3可检测PE-Cy5 / PerCP / PerCP-Cy5.5等5种荧光，但荧光搭配时只能选择一种荧光被此接收器检测。
② 各通道之间荧光素可随意搭配
如果流式细胞仪有4个通道，每个通道选出1个荧光素就可以组成4个颜色。
（2） 搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小
荧光的最大发射波长相差越大，荧光重叠就越小，这是由荧光光谱特征决定的。另外，不建议联用APC和Cy5串联荧光，因为他们之间光谱重叠较大，荧光补偿不易调节。

4色以内流式分析荧光素抗体组合

6色、8色、10色流式分析荧光素抗体组合

荧光选择注意事项:
1.选择荧光素应考率的因素
① 抗原密度：高表达抗原可以选择任何荧光素标记的抗体检测，低表达的抗原需要用较量荧光素（如PE/APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阴性细胞和阳性细胞的目的。
② 降低自发荧光：选择高波长范围里的荧光染料，自发光在高波长范围里（＞600nm）迅速降低。

2.应用FITC标记抗体避免使用酸性缓冲液
应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因为FITC的荧光特性是PH依赖性的。

3.串联染料确保未发生解偶联
串联染料有可能会发生解偶联，对“光漂白”和使用固定剂的“固定时间”更加敏感。建议设置一个“串联染料单染”作为对照，并在其他通道检测荧光的情况作为对比，以确保未发生解偶联。例如，应用PE/Cy5单染做对照时，分析PE通道的荧光信号。
[1] 刘艳荣. 实用流式细胞术. 北京：北京大学医学出版社，2017（3-39）.