背景描述

鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd= 20 nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片、细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。

鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品为iFluor™ 647标记的鬼笔环肽，具有高亮度和光稳定性，且染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。iFluor™ 647鬼笔环肽染色与用于细胞分析的其他荧光染色完全兼容，包括荧光蛋白、Qdot® 纳米晶体和其他iFluor™ 偶联物（包含iFluor™ 偶联二抗）。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。

本品以粉末小颗粒形式提供，请使用30 uL的DMSO溶解配置成1 mg/mL体系。

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。收到货后-20℃避光干燥保存，1年有效。

注意事项

1）鬼笔环肽具有毒性，需小心操作（对人的半数致死剂量LD50约2 mg/kg）。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

3）本产品仅作科研用途！

需要自备材料

1）1×PBS缓冲液， pH 7.4，细胞培养级别（货号：60145ES76）

2）固定液4%多聚甲醛（不含甲醇）（溶于PBS缓冲液）（货号：36314ES60）

3）透化液Triton X-100（溶于PBS缓冲液）

4）BSA，标准级别（货号：36101ES25）

5）DAPI染液（即用型）（货号：40728ES50）

操作步骤

1染色液的配置

1) 母液的配置：使用前将本品回温至室温并简短离心，加入30 μL DMSO使其充分溶解，混匀即可获得1000×iFluor™ 647标记鬼笔环肽母液。根据实验情况，对其分装并于-20℃避光干燥保存。

2) 工作液的配置：吸取1 µL1000×iFluor™ 647标记鬼笔环肽母液至1 mL PBS（含1%BSA）缓冲液中即可得到1×工作液。

【注】：不同的细胞染色情况不同，相应iFluor™ 647鬼笔环肽使用量也需根据不同情况而定。

2. 染色步骤

1）细胞培养过夜或更长，使其密度达到50-60%汇合度。

2）吸掉培液，37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗细胞2次。

3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定10-30 min。

【注】：避免固定剂中含有甲醇成分，因为甲醇在固定过程中可能破坏肌动蛋白。

4） 室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10 min。

 （可选）：室温条件下，用溶于PBS的0.1% Triton X-100溶液透化处理3-5 min，从而增加其通透性。

5）室温条件下，用PBS清洗细胞2~3次，每次10 min。

6） 取足够量新鲜配好的 iFluor™ 647标记鬼笔环肽工作液以覆盖住细胞，如：100 µL/孔（96孔板），室温避光染色20-90 min。

7）用PBS清洗细胞3次，每次5 min。

 （可选）：加入足量的即用型DAPI溶液对细胞核进行复染，如：100 µL/孔（96孔板），室温3~5 min。用PBS清洗细胞2次，每次5 min。

8）于荧光显微镜或者共聚焦显微镜下进行荧光观察，选择iFluor™ 647激发/发射滤片（Ex/Em=650/665 nm）和/或DAPI激发/发射滤片（Ex/Em=364/454nm）。