靶向CD19的CAR-T细胞（嵌合抗原受体T细胞）疗法是治疗复发或难治性B细胞恶性肿瘤的有效选择。共刺激结构域对CAR-T疗法的临床疗效至关重要，共刺激可增强细胞因子的产生、增殖和修饰T细胞的持久性。FDA批准临床使用的2个主要的共刺激结构域CD28和4-1BB的CAR-T临床反应率非常相似，但其细胞产物的动力学和表型存在显着差异。
2020年7月，来自美国马萨诸塞总医院研究团队在 Molecular Therapy （IF 11.452）上发表题为“A Distinct Transcriptional Program in Human CAR T Cells Bearing the 4-1BB Signaling Domain Revealed by scRNA-Seq”的研究文章，该研究整合了第一代和第二代人CAR T细胞的RNA测序(RNA-seq)和单细胞RNA测序(scRNA-seq) 数据，制作了人类CAR T细胞在静息和激活状态下的转录图谱，揭示了CARs胞内结构域介导的非抗原依赖性信号（Tonic signaling）和抗原依赖性信号通路。
研究材料
T细胞
技术路线
步骤1：用于转录分析的CAR-T细胞的CAR设计、转导和制备；
步骤2：CAR或TCR激活的CAR-T细胞信号特征；
步骤3：结构性转录谱变化：静息的CAR-T细胞具有CD3ζ和共刺激结构域的Tonic信号；
步骤4：抗原刺激转录变化：BBζ CAR T细胞中的抗原刺激导致与MHC II类基因表达相关的激活程序持续上调；
步骤5：抗原刺激诱导携带4-1BB和CD28共刺激结构域的CARS CD4+T细胞 Th1/Th2极化。
研究结果
1. 用于转录分析的CAR-T细胞的CAR设计、转导和制备
研究人员为了确定不同CARs下游的转录差异，合成四个带有不同信号域的CD19 CAR结构。从健康捐献者的外周血液中分离出CD4+和CD8+初级T细胞等比例混合，用抗CD3/CD28珠子激活，分别转导四种CAR结构(ζ、28ζ、BBζ和δζ)，或者不转导(UT)，通过CAR (内源性表达CD19的Nalm6细胞) 或TCR (使用珠子) 刺激4h或24h后进行转录组和单细胞转录组分析。
图1 CD19 CAR载体设计、转导以及实验流程
2. CAR或TCR激活的CAR-T细胞信号特征
为了研究不同CAR T细胞群体间变异的主要驱动因素，研究人员首先分析RNA-Seq数据，观察到T细胞激活后的转录反应根据T细胞接受刺激的时间和类型的不同而不同。为了确定差异源于每个细胞内刺激的程度或种类的差异而不是受到刺激的细胞百分比的不同，研究人员转向scRNA-seq图谱分析，发现T细胞刺激的主要差异也反映在单个细胞图谱上。进一步比较TCR和CAR刺激的T细胞和未刺激的T细胞中表达的基因，发现与TCR刺激相比，通过CAR刺激CAR T细胞产生更弱但相似的T细胞激活信号。
图2 通过CAR抗原刺激CAR T细胞比通过抗CD3TCR刺激产生更弱但相似的T细胞激活信号
3. 结构性转录变化：静息的CAR-T细胞具有CD3ζ和共刺激结构域的Tonic信号
为了分析与配体无关的信号，即“Tonic signaling”，研究人员检查了静息的CAR T细胞之间的差异：转录组数据表明携带功能性CD3ζ链的CAR在静止状态下有一个特定的、不依赖于抗原刺激的转录信号；单细胞转录组数据分析，静息状态下，只有bbζ CAR T细胞在群中的分布与所有其他细胞不同，进一步说明来自共刺激结构域的信号，特别是4-1BB，可以独立于抗原刺激之外来调节T细胞程序。
图3 静息CAR T细胞的转录信号表明通过CD3ζ和共刺激结构域的Tonic信号
4. 抗原刺激转录变化：BBζ CAR T细胞中的抗原刺激导致与MHC II类基因表达相关的激活程序的持续上调
接下来研究人员检查了CAR T细胞在抗原刺激后的转录变化，以及共刺激之间是存在转录差异：与静息和激活后的所有其他CAR细胞相比，HLA-DR在bbζ CAR T细胞中表达上调，且适用于激活后的抗EGFR T细胞，表明这种差异表达在bbζ CAR T细胞中是独立于CAR抗原结合域的。
为了确定这些基因是否是针对bbζ car T细胞中4-1BB的表达，而不是CD28的缺失，进一步比较了bbζ和ζ car T细胞之间的差异基因，发现在BBζ和28ζ中上调的基因同样上调，表明4-1BB的存在正向诱导这些基因的表达。
图4 带有4-1BB共刺激结构域的CAR T细胞持续上调MHCⅡ类基因
5. 抗原刺激诱导携带4-1BB和CD28共刺激结构域的CARS CD4+T细胞 Th1/Th2极化
为了确定CAR共刺激结构域使CD4+T细胞分化，研究人员分析了CD4+bbζ 或28ζ CAR T细胞中Th1和Th2极化基因的表达：在CAR刺激和静息状态下，CD4+bbζ CAR T细胞中Th1极化基因增强，而激活的28ζ 细胞中Th2早期极化基因丰富。CAR共刺激结构域的类型在CAR T细胞的极化中起着重要作用，尤其是在CAR刺激后。
单细胞转录组数据分析：观察到BBζ CAR T细胞与其他活化的CAR T细胞分离，而含有28ζ 和 ζ 的CAR T细胞的分布相似。潜在的狄利克雷分配（LDA）或“主题建模”方法分析单个免疫细胞的特征，表明不同的T细胞亚群可以激活类似的程序。
图5 携带4-1BB共刺激结构域的CARs的抗原刺激导致显著的Th1极化
小结
这项研究中采用两种测序方法（转录组与单细胞转录组）和无偏分析，生成了人类CAR T细胞在静止状态和激活后的转录图谱，揭示了CAR 细胞内结构域介导的非抗原依赖和抗原依赖的信号。发现静息CAR T细胞具有配体独立的信号，并随着共刺激域而变化。共刺激结构域的基线CAR中的组成性信号以及激活后的信号变化，会影响CAR T细胞表型、细胞命运和持久性。本研究扩展了我们对CAR信号域如何影响基因表达谱，功能状态和工程化人类T细胞最终命运的理解，为CAR T临床个性化治疗提供了新的理论基础。
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